Краткая история мультиплексного тестирования IgE

В первые годы нового тысячелетия первый микрочип с аллергокомпонентами был разработан в компании VBC Genomics в Вене, Австрия. Панель аллергенов этого теста включала 94 молекулярных аллергена и представляла собой диагностикум RUO - исследовательский продукт¹, который позже превратился в коммерческую платформу тестирования ISAC (твердофазный иммунный аллергочип). В конце 2007 года платформа ISAC была приобретена Phadia (Упсала, Швеция), в то время ведущим производителем систем для диагностики IgE in vitro². Панель аллергенов ISAC в то время включала 103 молекулярных аллергена. В рамках Phadia ISAC был переименован в ImmunoCAP® ISAC и в 2011 году был доработан до версии со 112 молекулярными аллергенами. В том же году Phadia была приобретена ThermoFisher Scientific³.

ImmunoCAP ISAC был усовершенствован в 2019 году до ISACE112i. Это привело к тому же количеству молекулярных аллергенов, некоторые были удалены (Api m 1, Api m 4, Jug r 2, Pla a 2, Pol d 5 и Ves v 5), другие были добавлены (Alpha-Gal, Ana o 3, Can f 4, Can f 6, Cor a 14 и Der p 23).

В 2016 году была основана новая компания MacroArray Diagnostics (MADx) с целью предложить более гибкие, надежные и доступные решения для систем мультиплексного тестирования аллергии. Основателем MADx был Кристиан Харванегг, PhD, который сыграл ключевую роль в разработке аллергочипа ISAC в VBC Genomics, Phadia и ThermoFisher Scientific ^4-6.

В отличие от созданной ранее системы ImmunoCAP ISAC, MADx разработал в 2017 году макро аллергочип (положительные сигналы видны невооруженным глазом), получивший название Allergy Explorer (ALEX), который содержал 156 экстрактов аллергенов и 126 молекулярных аллергенов⁷, а также общий IgE.

Два года спустя на рынок лабораторной диагностики был выпущен продукт-преемник ALEX² с набором из 180 молекулярных аллергенов, 120 экстрактов аллергенов и общим IgE. Это самый полный на сегодняшний день мультиплексный анализ IgE. Кроме того, в 2020 году была разработана полностью автоматизированная система обработки (MAX 45k), а также поддержка интерпретации с помощью специального программного обеспечения (RAVEN).

В 2025 году вышла новая версия ALEX³, с улучшенными аналитическими характеристиками и еще большим соотношением молекулы/экстракты в сторону молекулярных очищенных и рекомбинантных аллергокомпонентов, и количественным тестом на IgE общий. В настоящее время тест-система проходит процесс регистрации в РФ и странах СНГ.

Allergy Explorer – технология ALEX

 Базовая технология аллерготеста ALEX основана на двухэтапном процессе и представляет собой мультиплексный тест in vitro на основе ИФА с иммунохимическими методами анализа и детекции, как обсуждалось Heffler et al⁸.

Первоначально аллергены связываются с активированными наночастицами с учетом уникальных биохимических свойств каждого аллергена. Этот процесс обеспечивает высокую стабильность связанных аллергенов и, таким образом, полностью сохраняет сложность эпитопа. Использование наночастиц в качестве твердой фазы обеспечивает гораздо большую площадь связующей поверхности и последующее высокочувствительное обнаружение. На следующем этапе наночастицы, несущие аллерген, наносятся на нитроцеллюлозную мембрану, образуя макроскопический чип с индивидуальными параметрами анализа⁹.

В протокол анализа ALEX интегрирован ингибитор перекрестно-реактивных углеводных детерминант (CCD), который позволяет высокоспецифично определять сенсибилизацию путем блокирования специфических CCD антител в сыворотке крови пациентов. CCD относится к группе родственных гликанов, продуцируемых беспозвоночными и растениями, но не позвоночными. Считается, что выработка антител IgE против CCD у людей может быть индуцирована воздействием пыльцы и / или укусами насекомых¹⁰. Большинство природных аллергенов, полученных из растений или насекомых, содержат CCD, но CCD не действуют как аллергены in vivo и не являются клинически значимыми¹¹ у пациентов. В изученных 22% образцов сыворотки от пациентов с подозрением на сенсибилизацию к пыльце, продуктам питания или ядам насекомых были обнаружены антитела анти-CCD IgE, причем этот показатель достигал 35% в подростковой группе¹².

Диапазон измерения ALEX для специфического IgE составляет 0,1-50 kUA /L (количественно), а для общего IgE - 12500 kU/L (полуколичественно для ALEX² и количественно для ALEX³). Требуемый образец - 100 мкл сыворотки или плазмы. Результаты выражаются в kUA /L и в классах:

класс 0 (<0,3 kUA /L), класс 1 (0,3-1 kUA /L), класс 2 (1-5 kUA /L), класс 3 (5-15 kUA /L) и класс 4 (> 15 kUA /L). Аллергочип ALEX, ныне ALEX2, коммерчески доступен, имеет сертификат CE, который гарантирует, что качество анализа в отношении предела обнаружения, точности и воспроизводимости, а также специфичности и линейности соответствует диагностическим характеристикам in vitro. Высокий уровень общего IgE, гемоглобина, билирубина или триглицеридов не оказывает значительного влияния. Гибкое программное обеспечение для анализа Raptor (специально разработанное для ALEX и последующих продуктов) позволяет анализировать индивидуальные (программные) наборы аллергокомпонентов, которые считаются подходящими для тех или иных клинических задач (мультиплексные панели по запросу) ⁸.

Различия между MADx ALEX2 и ImmunoCAP ISACE112i

Table 1: Comparison ALEX² vs. ISAC E 112i

*CCD = ингибитор перекрестно-реактивных углеводных детерминант

На данный момент было проведено несколько сравнительных исследований между ALEX / ALEX² и ImmunoCAP ISACE112 ^{8, 14, 15, 16}.

Авторами установлено:

• ALEX², иммуноанализ на специфические IgE к экстрактам аллергенов и соответствующим молекулярным компонентам, представляет собой новый интересный подход в диагностике аллергических заболеваний «снизу вверх». Комбинация экстрактов и компонентов должна сэкономить время и деньги, когда требуется точный диагноз аллергии, особенно с учетом АСИТ у полисенсибилизированных пациентов и пациентов с синдромом перекрестной аллергии (оральной аллергии)⁸

• Несмотря на технические различия, результаты показали существенное соответствие между двумя методами¹⁴

• Одновременная детекция sIgE к экстрактам и молекулярным компонентам с помощью анализа ALEX потенциально может преодолеть некоторые из основных ограничений используемого в настоящее время мультиплексного анализа¹⁵.

• Новейший мультиплексный анализ ALEX2 статистически соответствует диагностике на основе экстрактов у пациентов с уровнем sIgE более 1,0 kUA /L с чувствительностью 97,3% ¹⁶.

Перспективы

Согласно Huang et al¹³ нереализованные потребности мультиплексного тестирования IgE включают:

1. Обширная библиотека определенных молекул аллергенов и пептидов.

2. Высокое качество и универсальность микрочипов.

3. Облегченная интерпретация, отчетность и принятие клинических решений.

4. Наличие разных форматов микрочипов для разных задач.

5. Доступность диагностики на основе микрочипов

В качестве дополнительной функции может быть добавлена ​​автоматическая обработка образцов пациентов, поскольку только лабораторная система с высокой пропускной способностью обеспечит использование мультиплексных тестов на IgE в более массовых обследованиях населения.

Система ALEX² полностью или частично покрывает все вышеперечисленные пункты:

1. Безусловно, самая большая панель молекулярных аллергенов

2. Высокое качество, подтвержденное несколькими публикациями ^{8, 14, 15, 16}

3. Интерпретация каждого результата автоматически включается в каждый лабораторный отчет ALEX².

4. Доступность различных форматов в ALEX2 обеспечивается с помощью программного обеспечения анализа (Raptor), где можно создавать разные комбинации панелей и выдавать соответствующие результаты для различных клинических и научных задач.

5. По сравнению с существующими платформами, ALEX² более выгоден и экономически эффективен. 

Резюме

В настоящее время только две IgE-мультиплексные системы позволяют анализировать широкий спектр аллергенов, MADx ALEX и ImmunoCAP ISACE112i. В то время как ImmunoCAP фокусируется исключительно на молекулярных аллергенах, из которых 6 являются уникальными, MADx ALEX предлагает 51 уникальный молекулярный аллергокомпонент в дополнение ко множеству экстрактов аллергенов и общему IgE.

Кроме того, использование ингибитора CCD позволяет проводить более специфические измерения IgE на чипе ALEX, особенно по сравнению тестами ImmunoCAP, которые склонны давать ложно завышенные результаты в CCD-положительных сыворотках пациентов ¹⁷ - проблема, которая может затронуть только несколько очищенных молекулярных аллергенов на ImmunoCAP ISACE112i.

С лабораторной точки зрения, возможность полной автоматизации системы MADx имеет явное преимущество перед полностью мануальной системой ISAC в отношении эффективности и потенциального использования мультиплексных тестов IgE в более широкой популяции.

Публикации по теме можно найти на сайте компании-производителя:

https://www.madx.com/science/publications